供稿机构：汉氏联合高等研究院南开大学博士后工作站
　　
　　作者：杨思俊博士、于淼英博士

　　衰老可能是每一个人一生都要面对的问题，从生物学角度来说，我们的DNA,RNA,细胞水平如何反应我们的衰老程度呢？这里面有哪些指标是和我们年龄密切相关的？通过这些指标的改善我们是否会实现延缓衰老呢？
　　
　　基于这些问题，本期细胞科技专栏，我们邀请了干细胞研究领域专家于淼英博士，和大家一起分享汉氏联合在衰老相关领域的研究内容，我们总结翻译了多篇文献，从DNA、RNA、细胞三个层面解读衰老的相关指标，为未来衰老指标体系的建立和诊断标准提供参考依据。
　　
　　不同的人生理衰老的速度有很大的不同，因此需要找到精确测量它的工具。生物体的每一个性状都是随年龄变化的，可以作为衰老的生物标记物，但并不是所有的生物标记物都具有信息量和诊断价值。本次专栏将综述衰老的基本分子和细胞生物标记物，这些标记物被细分为不同的组别(可以是分子、信号级联(或分子复合物)、细胞内结构或其功能)，这些标记物在衰老过程中会发生重大变化，可以为后期抗衰老效果的检测起到一定的参考意义。
　　
　　The American Federation For Aging Research
　　
　　美国老龄化研究联合会(The American Federation For Aging Research)关于衰老生物标记物的识别标准有四个内容，每个衰老的生物标记物都必须符合。这四个标准分别是：
　　
　　1、这个生物标记物可以预测衰老的速度。
　　
　　2、衰老生物标记物必须反映生理衰老的基本过程，而不能反映疾病的发病机制。
　　
　　3、它必须是可重复和非侵入性的，换句话说，对多次测试的人是无害的。
　　
　　4、它必须能在属于不同类群的模型动物身上重现。

　　毫无疑问，上述生物标志物是一种理想的模型。然而，至少远方的两个要求必须得到满足。随着生物信息学、组学的发展，有科研人员尝试用大数据的方式来解读衰老标志物的大量数据库，不幸的是，当进行了数千个维度(生物标志物价值的测量)的复杂研究数据分析时，不同数据的冗余给结果的分析和解释带来了很大的困难，即所谓的多维诅咒。为了方便分析，我们把衰老过程中分子生物标记物的多样性根据遗传信息转导水平或“分子生物学中心法则”的不同而细分为几类。
　　
　　1. 衰老的DNA相关生物标志物

　　端粒缩短被认为是最早描述的分子衰老生物标记物之一，端粒是包括位于染色体末端的核糖核蛋白的六聚体串联重复复合体，由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性，每次DNA复制都会使端粒变短，但有一种名为端粒酶的酶可以重新合成丢失的端粒重复序列。该酶主要在永生化细胞和干细胞中有活性，但在体细胞中有活性被抑制。端粒在以某种方式激活端粒酶后会改变其长度。细胞中端粒的长度表明组织的复制状态。利用增殖细胞中端粒磨损的组织特异性动态轮廓，可以预测预期寿命和老年率。
　　
　　有两个与端粒相关的的衰老生物标志物被充分研究：血液白细胞端粒长度和端粒DNA损伤反应诱导的蛋白质。此外，3q26位点(Rs12696304)也被鉴定为衰老加速因子。它编码TERC，一种人类端粒酶的核糖核成分。携带上述基因变异的个体与具有正常基因的个体的生物学年龄不同，根据端粒长度，这种差异相当于3-4年生物学年龄。
　　
　　与DNA相关的生物标记物是甲基化组谱，也被称为表观遗传时钟。由于其高精度，它可能是研究最深入的生物年龄标记，使用表观遗传学时钟可以以3.5年的精度估计生物年龄；总共有353个CpG甲基化岛，其中193个位点高度甲基化，与衰老呈正相关，160个岛的低甲基化与衰老呈负相关。在生长个体中观察到对数曲线(来自353CpG甲基化的信号)，之后“时钟”的速度减慢，当成年开始时，该曲线变为线性。
　　
　　DNA甲基化并不是在衰老基因组中观察到的唯一修饰，表观遗传生物标志物是多样的，并且与组蛋白修饰相关，例如衰老相关的异染色质或组蛋白丢失，但是在衰老的背景下，染色质和组蛋白生物标志物知之甚少。衰老改变了CpG羟甲基化水平，这一过程尚未像DNA甲基化那样得到深入研究，生物标记物仅用于肝活检，并在人脑上进行了测试。
　　
　　线粒体DNA拷贝数也可作为为年龄的生物标记物。比如，随着年龄的增长线粒体DNA的质量而降低，可以通过间接测量的线粒体基因组的值来反应(使用细胞色素c氧化酶(COX)mRNA的表达来表征)。此外，血浆中循环的无细胞线粒体和基因组DNA被认为是几种疾病的诊断标记物，但在非老年人群(90岁以上)中，其碎裂程度，特别是低分子量部分，可用于预期寿命测量。
　　
　　2. 与RNA相关的衰老生物标志物

　　后基因组时代各类技术的发展给衰老生物标记物选择的提供了新视角，Peters等人研究显示了对血液样本转录图谱进行“转录年龄”测量的可能性，该研究使用了一个人数巨大数据库(超过14,000名欧洲血统的人)数据集进行比较，其中差异表达基因(共1497个序列)被选为“转录组年龄”的指标。
　　
　　毫无疑问，转录图谱是非常多样化的，RNA的某些特定部分可能被用作衰老的生物标志物。比如非编码RNA片段，其水平与年龄相关。在血浆中循环的miRNA组的短序列(小于23个碱基)首次与小鼠的衰老有关。MiR-21组与人和小鼠听力损失以及炎症有关。
　　
　　另外，循环的miRNAs作为生物标记物在健康和不健康的衰老轨迹中也有相关研究。比较了百岁老人组、他们的后代和具有典型衰老速度的人之间miRNA水平的变化。在百岁老人组中，miR-106a、miR-126、miR20a、miR-144、miR-18a随年龄增长下调，与老年组相比，其他组miR-320d、miR-320b上调。Olivieri还检测到老年人血浆中miR-21表达下调，而65岁以下人群中miR-21表达上调，并且，miR-363、miR-1974、miR-223、miR-148A、miR-148A对EBV病毒感染的永生化B细胞均有促进作用。Serna等测试了百岁老人与老年人和年轻人的单个核细胞，并研究了miR-21和miR-130a的上调对衰老的影响。
　　
　　在年老的供者血清中，Hooten等发现miR-151a-3p、miR-181a-5p、miR-1248水平下降。Meder等发现miR-34a-5p、miR-145-5p、miR-1284、miR-93-3p和miR-1262水平与年龄呈正相关。Amling等观察到miR-126-3p、miR-21-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-142-3p、let-7a-5p随年龄增长水平升高，miR-93-5p下调。
　　
　　还有一类，长非编码(LNC)RNA是转录组的另一部分，被认为与衰老密切相关。“衰老的标志”分类中的每一个与衰老相关的过程都受到许多长的非编码RNA的调控，因此lncRNA决定了年龄相关疾病中的基因表达模式，这些序列被认为是能量代谢和免疫反应的调节器，以及神经退化和增殖的调节器。例如，在人类中，MIR31HG或Meg3水平的升高与细胞衰老密切相关。
　　
　　3. 衰老的蛋白质组和代谢组学生物标志物。

　　衰老的基本蛋白质组学标志是在最早的蛋白质质谱工作中检测到的。通过对健康对照组和不健康实验组个体蛋白质组和代谢谱的比较，发现与衰老相关的蛋白质组和代谢组变化有很大差异。
　　
　　有几种年龄相关的病理，如阿尔茨海默氏症和帕金森氏病，II型糖尿病，动脉粥样硬化，心力衰竭，冠状动脉疾病，它们都有自己的标志物，由于后四种疾病的高渗透率，对健康衰老生物标志物的搜索由于总代谢网络的改变而变得非常复杂。Gregory等总结在蠕虫、小鼠和人类上进行的大量代谢学和蛋白质组学实验中获得的数据，可以清楚地看出，代谢谱具有更强的可靠性，并且对衰老有更直接的反应，相反，在衰老模型中差异表达的蛋白质数量要少得多。
　　
　　4. 广泛使用的衰老代谢生物标志物

　　代谢组本身是衰老的生物标志物，但代谢组学方法对于全科医生、内科医生或老年医生等人的日常使用来说过于复杂和时间成本过高，我们整理了几个也在代谢组学研究中确定的衰老的基本生物标志物。
　　
　　Chaleckis等使用液相色谱和质谱方法将年轻人队列中采集的血液样本与老年人的样本进行了比较。在这项研究中，总共检测到126种代谢物，每个个体的每种化合物都测量了一个变异系数。结果表明，血液中发现的14种代谢物随年龄的增长而显著变化(增加或减少)：1，5-脱水葡萄糖醇、二甲基鸟苷、乙酰肌肽、肌肽、邻苯二甲酸、UDP-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰精氨酸、N6-乙酰赖氨酸、泛酸、瓜氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、NAD+和NADP+。然而，在众多研究中，这些并不是唯一的代谢组学衰老生物标志物。
　　
　　脂类代谢也在衰老过程中受损，因此脂质体的不同部分会随着年龄的增长而改变水平。甘油三酯的水平随着年龄的增长而增加，因此这一组分可以被认为是衰老的生物标记物。根据Mata分析，胆固醇(总)、低/高密度胆固醇(脂蛋白)也是发病率和死亡率的预测因子，而磷脂和鞘脂被认为是健康衰老的标志。
　　
　　还有，蛋白质代谢中有许多产物可以作为衰老的生物标志物。氨基化蛋白质的积累是多肽非酶翻译后修饰的结果，主要是蛋白质的N末端被修饰，也发生在含有Lys或Arg的侧链上。尿素分解产生的异氰酸与蛋白质和多肽的N-末端和侧链反应。在这种情况下，最优先的目标是基质蛋白，如I型胶原和弹性蛋白，具有较长的半衰期。在衰老的背景下，晚期糖基化终产物(AGEs)成为一个当前的问题；蛋白质、脂质和核酸通常在高糖溶液暴露期间糖基化，这个过程发生在没有酶存在的情况下，它们的积累导致炎症和细胞凋亡，并表明在与年龄相关的肥胖以及糖尿病。
　　
　　不同的代谢反应都有副产物，往往环境影响导致氧化应激，因此氧化损伤标志物在生物体中广泛分布，其数量通常随着年龄的增长而增加，因为氧化应激是衰老的原因和结果，因此此类化合物恰好适合于衰老生物标志物的检测。例如，3-硝基酪氨酸、3-氯酪氨酸和邻酪氨酸等化合物与衰老过程中的蛋白质损伤密切相关。丙二醛、4-羟基-反己烯醛、4-羟基-反式壬烯醛、8-异前列腺素F2α和醛C6-C12通常被用作衰老过程中脂质氧化损伤的生物标志物。8-羟基-2-脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷等化合物是DNA在促氧化剂处理和氧化应激源暴露下损伤时出现的，因此这些残留物可以作为衰老相关氧化损伤的指示物。
　　
　　5. 衰老的细胞生物标志物

　　为了将衰老的细胞生物标记物系统化，我们将它们分成以衰老标志命名的类别。它们是线粒体功能障碍的标志物、细胞间通讯失调的标志物、细胞衰老和蛋白稳定性丧失的标志物。衰老的细胞标志物多为细胞或细胞器和细胞群体形成的表型。
　　
　　线粒体过氧化氢的产生是最早的生物标志物之一，它是通过使用α-甘油磷酸酯作为底物的荧光检测试验来测量的。LON蛋白酶活性降低，乌头酸酶周转率随年龄显著变化，它们共同表明线粒体功能障碍。老年骨骼肌线粒体主导酶(柠檬酸合成酶)水平降低，线粒体氧化磷酸化能力随年龄增长而降低，线粒体ATP的产生也随之降低，我们在上面已经提到，老年个体细胞中线粒体DNA和RNA的含量较低。
　　
　　循环中的细胞成分、细胞器、自由基、过氧化脂质、各种代谢物，如细胞外ATP、神经酰胺、尿酸盐结石、琥珀酸、淀粉样蛋白等都与细胞间通讯有关，因为特定的感应器分子可以识别它们，从而诱导对细胞应激的反应。此外，可能是热休克蛋白、S100、高迁移率族蛋白1或组蛋白的DAMP是衰老的候选生物标志物，表明细胞死亡和免疫反应。
　　
　　NLRP3，也被称为炎症小体，激活Pro-Caspase-1，然后释放IL-1β和IL-18(致炎细胞因子)。我们的天然免疫主要针对它们的成分，因此心磷脂作为一种抗原(以及其他类似病原体的化合物)可以促进内源性炎症和免疫反应，这种反应主要由Nlrp3和其他感应器或下游级联元件激活的各种信号分子所代表。
　　
　　C-反应蛋白、白细胞介素-6和α1-抗糜蛋白酶与大脑加速老化和认知衰退有关。对内源性致病基因类分子的促炎反应并不是促进细胞衰老的唯一变体。它还与产生衰老相关分泌表型(SASP)的衰老细胞相连。趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子-α、IGF结合蛋白、基质金属蛋白酶、单核细胞趋化蛋白-1和已经提到的IL-6的增加在与慢性炎症(炎症)和细胞衰老相关的衰老中可以观察到。
　　
　　在有丝分裂活性高的组织中，衰老细胞的数量反映了细胞衰老的过程，有几种细胞衰老的生物标志物。蛋白β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)活性升高、p16INK4A表达增强和Rb低磷孢子扩散是细胞衰老的最典型的生物标志物，在受试细胞中有两种内表型：细胞周期停滞、对有丝分裂原的抗性和致癌转化。这些特征是可以测量的，并且适合作为与细胞衰老有关的衰老过程的生物标志物。
　　
　　细胞间蛋白平衡由三个基本系统组成：泛素蛋白酶体系统、自噬小体和伴侣分子。第一个系统参与蛋白质降解，第三个系统辅助蛋白质折叠，增强其稳定性。有几个过程可以作为蛋白稳定性评估的指标，人们可以将这些过程的数量特征用作衰老的特定生物标记物。我们列举了与年龄相关的蛋白稳定性丧失的主要过程：伴侣蛋白耗竭增加，细胞内蛋白质聚集和聚集体出现，大自噬功能受损，其活性降低，受体识别、吞噬诱导和APG-Lys融合也减少。已知在老年生物体中伴侣介导的自噬和L2A水平降低。同样的说法对于UPS活性、泛素化和亚单位水平的组装也是正确的，这些标记物是减少的，因此所有上述被测量的过程都可以作为老化的生物标记物。
　　
　　总  结
　　
　　总体而言，衰老的生物标志物分寸丰富，它们在精确度和可靠性以及可重复性方面差异很大，通常不可能挑选出最好的生物标志物，因为只有描述衰老过程的一组生物标志物(不仅是细胞和分子的)才可能真正提供信息。
　　
　　准确地说，“越多越好”是该领域的主导原则。在当前和未来预测医学和个性化医学的背景下，我们必须确定可靠的标记物，研究好衰老标记物的检测标准，才能使个体衰老轨迹的准确预测成为现实。

　　参考文献：
　　
　　1. https://www.afar.org
　　
　　2. https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-030-24970-0
　　
　　合作作者简介
　　
　　于淼英博士，中国农业科学研究院博士后，长期从事动物胚胎干细胞研究，目前为上饶师范学院副教授，主持国家自然科学基金项目、江西省自然科学基金项目。